蛋白質表達與檢測
提供從高靈敏度檢測到空間定位分析的全套方案，精準量化目標蛋白的表現水準
Western Blot
蛋白質免疫墨點（Western Blot，WB）是分子生物學、生物化學及臨床醫學領域中最常用的蛋白分析技術之一，核心用於檢測樣本中特定蛋白質的表達水平、分子量驗證及蛋白修飾（如磷酸化、乙醯化）分析。其憑藉高特異性、高靈敏度的優勢，成為蛋白表達研究中不可或缺的核心手段。WB 技術廣泛應用於基礎科研與臨床檢測：基礎研究中可用於驗證基因表達產物、分析蛋白相互作用、探究訊號路徑活化狀態；臨床場景中可輔助腫瘤標記物檢測、病原體篩查與疾病分型診斷等。相較於其他蛋白檢測技術，WB 能同時實現蛋白定性與半定量分析，為科研結論與臨床診斷提供可靠的實驗依據，被譽為蛋白表達分析的「黃金標準」。
原理介紹
WB 實驗核心基於抗原與抗體的特異性結合原理，藉助膠體電泳的分離特性與訊號放大技術，實現對目標蛋白的定性、半定量分析與分子量驗證，核心原理如下：目標蛋白作為抗原，具有獨特的抗原決定位，可與針對該位點的特異性一抗發生高度專一性結合，形成抗原-一抗複合物。為實現訊號視覺化，需加入標記二抗，二抗可特異性辨識並結合一抗的恆定區，建構「目標蛋白-一抗-二抗」三級複合物體系。二抗通常標記有酶（如辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶）或螢光基團，標記物可透過特定反應產生可偵測訊號——酶標記二抗可催化化學冷光受質（如 ECL）產生螢光訊號，螢光標記二抗可直接發出特定波長螢光。透過偵測訊號的有無、強弱及位置，即可判斷目標蛋白是否存在、表達水平高低及分子量大小，為蛋白相關研究提供精準依據。
文獻案例
《cell death & disease》發表題為「Role of the PI3K/AKT signaling pathway in the cellular response to Tumor Treating Fields (TTFields)」的論文。研究以人類膠質母細胞瘤 U87 細胞為模型，設置對照組、TTFields 單獨處理組及 PI3K 抑制劑聯合 TTFields 處理組，經對應處理後提取各組細胞總蛋白，採用 WB 技術檢測 PI3K/AKT 路徑關鍵蛋白及自噬、凋亡相關蛋白的表達水平。結果顯示，TTFields 單獨處理可顯著下調細胞中磷酸化 PI3K（p-PI3K）、磷酸化 AKT（p-AKT）及下游 mTOR 蛋白的表達，同時上調自噬相關蛋白 LC3-II/LC3-I 比值及凋亡相關蛋白 Caspase-3 的活化水平。而 PI3K 抑制劑聯合 TTFields 處理後，上述蛋白表達變化更顯著，p-AKT 表達水平進一步降低，細胞凋亡率明顯升高，提示抑制 PI3K/AKT 路徑可增強腫瘤細胞對 TTFields 的敏感性。該研究透過 WB 技術精準驗證 PI3K/AKT 路徑的活性狀態與腫瘤細胞對 TTFields 的應答密切相關，為透過標靶 PI3K/AKT 路徑提升 TTFields 治療效果提供明確實驗支撐，也凸顯 WB 技術在腫瘤治療機制研究中的核心價值。
送樣標準
濃度≥500ng/μL，體積≥50μL，-20℃ 保存，冰袋運輸；需附帶測序報告及載體圖譜
新鮮葉片 / 癒傷組織＞1g / 份，4℃ 冷藏運輸，24h 內送達；需註明植物品種及生長狀態
細胞株需提供活力＞90% 的凍存細胞，乾冰運輸；原生質體需新鮮製備，冰袋運輸，12h 內送達；需註明細胞類型及培養條件
誘餌蛋白 / 獵物蛋白基因序列（FASTA 格式），需明確切割位點及融合方向
交付內容
原始實驗資料
WB 實驗原始顯影圖（包含目的蛋白、內參蛋白條帶）、灰階值定量原始資料、電泳與轉印參數記錄。
資料分析報告
目的蛋白分子量驗證結果、灰階值分析統計圖（目的蛋白/內參蛋白灰階比值）、蛋白表達水平半定量結論、實驗結果解讀。
常見問題
①蛋白樣本降解，需在萃取過程中添加足量蛋白酶抑制劑，全程低溫操作；②膠體濃度不適，可根據目標蛋白分子量調整膠體濃度（小分子蛋白用高濃度膠體，大分子用低濃度膠體）；③上樣量過多導致蛋白過載，需減少上樣量；④一抗濃度過高產生非特異性結合，可降低一抗濃度並延長封閉時間。
①優化封閉條件，延長封閉時間或更換封閉液（如脫脂牛奶換 BSA）；②調整一抗孵育條件，降低濃度、縮短孵育時間或提高孵育溫度；③增加洗膜次數與時間（用 TBST 緩衝液充分洗滌），去除非特異性結合的抗體；④選用特異性更高的一抗（如單株抗體替代多株抗體）。
①確保上樣量一致，提前精準測定蛋白濃度並調整樣本體積；②檢查內參抗體特異性，避免內參蛋白降解；③優化電泳與轉印條件，確保蛋白均勻分離與轉印；④若內參條帶差異過大，需重新萃取蛋白並進行實驗，保證實驗重複性。
