蛋白表达与检测
提供从高灵敏度检测到空间定位分析的全套方案，精准量化目标蛋白的表达水平。
Pull-down
蛋白下拉实验（Pull-Down）是基于抗原-抗体结合或标签-配体相互作用原理，体外研究蛋白质间特异性相互作用的经典分子生物学技术。该技术可直接从细胞裂解液或蛋白混合物中 “捕获” 与诱饵蛋白相互作用的目标蛋白（猎物蛋白），克服了免疫共沉淀（Co-IP）依赖特异性抗体、难以研究低丰度蛋白互作的缺陷，兼具操作简便、特异性强、结果直观的特点。Pull-Down技术无需维持细胞内环境，可灵活控制反应条件，既适用于验证已知蛋白间的直接相互作用，也能通过质谱鉴定筛选诱饵蛋白的未知互作搭档，广泛应用于信号通路调控、蛋白复合物组成分析、药物靶点筛选等领域，是解析蛋白质相互作用网络的核心工具之一。
原理介绍
Pull-Down 的核心原理是将带有标签的诱饵蛋白（如His-tag、GST-tag、Flag-tag）固定在固相载体上，利用标签与配体的特异性结合，从样品中捕获能与诱饵蛋白相互作用的猎物蛋白，最终通过检测验证互作关系，关键步骤如下：构建带有标签的诱饵蛋白表达载体，通过原核或真核系统表达并纯化诱饵蛋白；将纯化的诱饵蛋白与对应标签的固相载体（如GST-tag适配GSH琼脂糖珠、His-tag适配Ni-NTA磁珠）孵育，使诱饵蛋白通过标签固定在载体上，形成 “载体 - 诱饵蛋白”复合物；向复合物中加入含猎物蛋白的样品（细胞裂解液或纯化蛋白），在适宜条件下孵育，使诱饵蛋白与猎物蛋白通过特异性相互作用结合；经多次洗涤去除未结合的杂蛋白，再通过洗脱液将 “载体-诱饵蛋白-猎物蛋白” 复合物洗脱，最后通过Western Blot 检测已知猎物蛋白，或通过质谱鉴定未知猎物蛋白。
文献案例
《Nature Communications》发表研究论文“OsMAPK6 phosphorylation and CLG1 ubiquitylation of GW6a non-additively enhance rice grain size through stabilization of the substrate “，揭示了水稻籽粒大小的调控机制。研究人员推测激酶OsMAPK6可能磷酸化正向调控因子GW6a。为验证两者直接互作，利用GST Pull-Down实验，构建并纯化了GST-OsMAPK6与MBP-GW6a融合蛋白。将GST-OsMAPK6固定于琼脂糖珠后，与MBP-GW6a共孵育。Western Blot结果显示，实验组洗脱液可检出MBP-GW6a条带，而空载GST对照组无信号，证实了体外直接互作。进一步的体内实验在烟草叶片中完成：共表达OsMAPK6-GFP与GW6a-Myc，利用GFP抗体进行免疫沉淀后可检测到Myc信号，表明体内复合物形成。结合后续磷酸化实验，该研究明确OsMAPK6通过直接磷酸化GW6a特定位点来增强其稳定性，从而协同调控籽粒发育。
送样标准
浓度≥0.5mg/mL，体积≥200μL，纯度＞80%，-80℃保存，干冰运输；需提供标签类型（GST/His/Flag 等）及纯度检测报告
浓度≥1mg/mL，体积≥1mL，-80℃保存，干冰运输；需注明细胞系名称及处理条件，确保蛋白未降解
＞1g / 份，液氮速冻后 - 80℃保存，干冰运输；需明确组织部位，避免样本解冻
浓度≥0.3mg/mL，体积≥100μL，-80℃保存，干冰运输；需提供蛋白活性验证报告
浓度≥500ng/μL，体积≥50μL，-20℃保存，冰袋运输；需提供质粒图谱及序列信息
交付内容
Pull-Down 原始实验数据
Input 组、阴性对照组、Pull-Down 组的 Western Blot 原始图谱，条带灰度值定量分析结果；
互作验证报告
明确蛋白间是否存在直接相互作用的结论，结合对照组结果排除假阳性，提供条带对比分析；
技术支持文档
提供实验优化建议（如缓冲液配方调整、蛋白浓度优化）、常见问题排查指南，若为质谱鉴定则提供蛋白鉴定列表及生信分析报告。
常见问题
①载体或标签非特异性结合，在反应体系中加入 1% BSA 或脱脂奶粉，封闭非特异性结合位点；②洗涤不充分，增加洗涤次数（5-6 次），或在洗涤缓冲液中适当提高盐浓度；③猎物蛋白自身聚集，将猎物蛋白样品离心（14000rpm，10min）去除沉淀后再使用；④诱饵蛋白纯度不足，进一步纯化诱饵蛋白，去除杂蛋白干扰。
①增加诱饵蛋白固定量，延长诱饵蛋白与载体的孵育时间至 4h；②提高猎物蛋白浓度，增加样品上样量；③优化洗脱条件，使用高浓度洗脱液（如高浓度谷胱甘肽、咪唑），或延长洗脱时间；④选择灵敏度更高的检测抗体，或采用化学发光增强试剂盒提升信号强度。
①使用纯化的重组诱饵蛋白和猎物蛋白进行 Pull-Down 实验，排除中间蛋白介导的间接互作；②构建诱饵蛋白的截短体，明确互作结构域，若截短体仍能与猎物蛋白结合，证明两者存在直接互作；③结合双分子荧光互补（BiFC）等细胞内原位互作技术，进一步验证直接相互作用。
