蛋白質表達與檢測
提供從高靈敏度檢測到空間定位分析的全套方案，精準量化目標蛋白的表現水準
Dual-Luciferase
雙螢光素酶報告基因實驗（Dual-Luciferase Reporter Assay, Dual-LUC）是基於螢光素酶催化受質發光原理，用於研究基因表達調控（如啟動子活性、轉錄因子結合、訊號路徑調控）的分子生物學技術。該技術透過同時引入兩種螢光素酶（報告螢光素酶與內參螢光素酶），克服傳統單螢光素酶實驗中樣本差異、轉染效率不均等干擾因素，實現對標的基因表達的精準定量。其核心優勢在於特異性強、靈敏度高、結果重複性好，可動態反映基因調控的即時變化，廣泛應用於啟動子活性分析、轉錄因子-DNA 結合驗證、miRNA 標靶調控驗證與訊號路徑活性檢測等領域。相較於膠體遷移實驗（EMSA）、酵母菌單雜（Y1H）等技術，Dual-LUC 能在活細胞內模擬生理條件下的基因調控過程，更貼近生物體內真實情況，是基因調控機制研究中不可或缺的核心工具。
原理介紹
雙螢光素酶實驗的核心是螢火蟲螢光素酶（Firefly luciferase, FLuc）和海腎螢光素酶（Renilla luciferase, RLuc）兩種不同來源的螢光素酶。透過同時檢測兩種不同螢光素酶的活性，以便對基因表達、轉錄調控或訊號路徑進行更為詳細與準確的分析。關鍵步驟：建構重組載體：將標的基因啟動子片段或調控序列選殖至報告螢光素酶載體（如螢火蟲螢光素酶載體 pGL4.10），形成「啟動子-報告酶」融合載體；內參螢光素酶載體（如海腎螢光素酶載體 pRL-TK）作為對照，其表達不受標的基因調控；共轉染細胞：將報告載體與內參載體按一定比例共轉染至目標細胞，同時設置空白對照（僅轉染空載體）和陰性對照（轉染突變型啟動子載體）；螢光訊號檢測：轉染後培養一段時間，裂解細胞並加入兩種螢光素酶的特異性受質，螢火蟲螢光素酶（Firefly Luciferase）催化 D-螢光素產生黃綠光（波長～560nm），海腎螢光素酶（Renilla Luciferase）催化腔腸素產生藍光（波長～480nm）；結果校準與分析：以海腎螢光素酶的螢光強度（Rluc）為內參，校準螢火蟲螢光素酶的螢光強度（Fluc），透過計算 Fluc/Rluc 比值，消除轉染效率、細胞活性等差異帶來的影響，精準反映標的基因的表述調控水平。
文獻案例
《Journal of Neuroinflammation》上題為「Exosomal miR-409-3p secreted from activated mast cells promotes microglial migration, activation and neuroinflammation by targeting Nr4a2 to activate the NF-κB pathway」的研究，利用雙螢光素酶報告實驗，清晰證實了外泌體 miR-409-3p 在神經發炎中的關鍵作用。前期研究提示，肥大細胞來源的外泌體 miR-409-3p 可能標靶抑制 Nr4a2 基因。為驗證這一直接調控關係，研究人員首先透過生物資訊預測了 Nr4a2 基因 3'UTR 上的潛在結合位點。隨後，他們建構了兩種關鍵的報告質體：一種是將含有該預測位點的野生型 3'UTR 序列插入螢光素酶報告基因下游（WT 型）；另一種是對該結合位點進行種子區突變（MUT 型）。在實驗中，研究人員將這兩種報告質體分別與 miR-409-3p 模擬物（實驗組）或陰性對照 miRNA，以及海腎螢光素酶內參質體共同轉染至細胞。雙螢光素酶檢測結果清晰顯示：與對照組相比，miR-409-3p 模擬物能顯著抑制 WT 型報告質體的螢光素酶活性，但對 MUT 型報告質體的活性無影響。這一結果為「Nr4a2 是 miR-409-3p 的直接標的基因」提供了最確鑿的證據。
送樣標準
濃度≥500ng/μL，體積≥50μL，-20℃ 保存，冰袋運輸；需附帶測序報告及載體圖譜
細胞株需提供活力＞90% 的凍存細胞，乾冰運輸；原生質體需新鮮製備，冰袋運輸，24h 內送達；需註明細胞類型及培養條件
提供 PCR 擴增後的純化片段（濃度≥200ng/μL，體積≥30μL）或基因序列（FASTA 格式），-20℃ 保存，冰袋運輸
＞1g / 份，液氮速凍後 -80℃ 保存，乾冰運輸；需明確組織類型（如葉片、癒傷組織）
交付內容
轉染與檢測原始資料
各實驗組與對照組的 Fluc 值、Rluc 值、Fluc/Rluc 比值資料表，螢光訊號檢測原始圖譜；
定量分析报告
統計分析結果（如 t-test 或 ANOVA）、差異顯著性標註、相對活性長條圖，明確基因調控作用結論；
技術支援文件
提供實驗優化建議（如轉染條件優化、載體比例調整）、常見問題排查指南，以及後續驗證實驗（如 EMSA、ChIP）的設計建議。
常見問題
①轉錄因子或啟動子載體建構錯誤，重新測序驗證載體序列，確保啟動子片段插入方向正確、轉錄因子基因編碼區完整；②轉染載體比例失衡，調整報告載體、內參載體、轉錄因子載體的比例（通常為 10:1:5），避免內參訊號過強或轉錄因子表達不足；③細胞類型不適合，更換與標的基因天然表達相關的細胞株或原生質體，模擬生理調控環境；④調控作用依賴特定訊號誘導，加入對應的訊號分子（如激素、脅迫處理）後再進行檢測。
①內參載體轉染量不足，適當增加 pRL-TK 載體在轉染體系中的比例；②內參載體表達效率低，更換啟動子更強的內參載體（如 pRL-CMV）；③細胞裂解不充分，內參酶未完全釋放，優化裂解條件（如延長裂解時間、增加裂解液體積）；④螢光受質失效，更換新鮮配製的海腎螢光素酶受質，避免受質降解。
①受質配製後未及時使用，螢光素酶受質需現配現用，避免長時間暴露在室溫或光照下；②裂解液中存在抑制劑，確保裂解液無 RNase、蛋白酶污染，或在裂解液中加入酶保護劑；③檢測操作速度過慢，優化實驗流程，確保裂解後 30min 內完成螢光檢測；④使用具有訊號穩定功能的雙螢光素酶檢測儀，延長訊號採集時間窗口。
