蛋白質表達與檢測
提供從高靈敏度檢測到空間定位分析的全套方案，精準量化目標蛋白的表現水準
qPCR
即時螢光定量 PCR（qPCR）係於傳統 PCR 技術基礎上發展而來的核酸定量分析技術，可在 PCR 擴增過程中即時監測螢光訊號變化，實現對起始模板核酸的精準定量。qPCR 透過追蹤反應中累積的螢光訊號，實現對起始模板 DNA 的精確定量，其核心為 Ct 值——每個反應管內螢光訊號達到設定值時所經歷的循環數。起始模板量越少，達到閾值所需循環數越多，Ct 值越高。該技術突破傳統 PCR 僅能定性或半定量的侷限，兼具高靈敏度、高特異性、高準確性及快速高效的特點，能偵測低至數個拷貝的核酸模板。目前 qPCR 已廣泛應用於基因表達差異分析、病原體核酸檢測、基因工程驗證與轉基因成分鑑定等領域，是分子生物學、醫學診斷與農業科研等方向的核心實驗技術之一，相較於傳統 PCR，其無需後續電泳檢測，減少實驗污染風險，且資料重複性與可信度大幅提升。
原理介紹
即時螢光定量 PCR（qPCR）的核心是透過螢光訊號的即時變化追蹤 PCR 擴增進程，實現對擴增過程的即時追蹤與定量。依據螢光標記方式不同，主要分為 SYBR Green 染料法與 TaqMan 探針法兩類，核心機制如下：SYBR Green 染料法：SYBR Green 為一種能特異性結合雙股 DNA 小溝的螢光染料，未結合 DNA 時螢光訊號微弱，結合後螢光強度可增強數十倍。PCR 擴增過程中，隨著雙股 DNA 產物累積，染料與產物結合量逐漸增加，螢光訊號同步增強，透過監測螢光訊號的增長曲線，即可實現對模板的定量分析。TaqMan 探針法：在引子之外額外設計一段特異性探針，探針 5' 端標記報告螢光基團，3' 端標記淬滅螢光基團。探針完整時，報告基團的螢光會被淬滅基團吸收而無法偵測；PCR 擴增的延伸階段，Taq 酶的 5'→3' 外切酶活性會水解探針，使報告基團與淬滅基團分離並釋放螢光，螢光訊號強度與 PCR 產物量呈正相關，以此實現定量。
文獻案例
《Rice》發表題為「The Mediator Subunit OsMED16 Interacts with the WRKY Transcription Factor OsWRKY45 to Enhance Rice Resistance Against Magnaporthe oryzae.」的研究論文，透過 qPCR 確認中介體亞基基因 OsMED16 受稻瘟病菌侵染誘導表達；進而透過 qPCR 分析發現，於 Osmed16 突變體中，一組負責合成抗菌物質二萜類植物抗毒素的關鍵基因表達量顯著下降，直接將這些基因的表達缺失與突變體感病表型相關聯。於過表達 OsMED16 的植株中，不僅這些抗毒素基因被強烈誘導，轉錄因子 OsWRKY45 及其相互夥伴 OsWRKY62 的表達也受到影響。結合酵母菌單雜交與 ChIP 等實驗，研究證實 OsMED16、OsWRKY45 與 OsWRKY62 形成三元複合體共同結合標的基因啟動子，而此結合的生物學功能最終再次透過 qPCR 得以驗證：該複合體能直接活化下游抗菌物質的生物合成基因。因此，整項研究透過一系列 qPCR 定量分析，逐步建構出「OsMED16-OsWRKY45 複合體透過直接上調抗菌合成基因表達來增強水稻抗病性」的清晰結論，充分展現 qPCR 於基因表達定量與功能機制解析中的關鍵作用。
送樣標準
＞0.03g / 份，液氮速凍後 -80℃ 保存，乾冰運輸，避免反覆凍融
＞0.1g / 份，液氮速凍後 -80℃ 保存，乾冰運輸
＞0.02g / 份，液氮速凍後 -80℃ 保存，乾冰運輸
＞200μL / 份，-80℃ 保存，乾冰運輸，禁止反覆凍融
＞1×10⁵ 個 / 份，PBS 清洗後離心收集，液氮速凍 -80℃ 保存，乾冰運輸
RNA 濃度≥200ng/μL、260/280≈2.0；cDNA 濃度≥50ng/μL，-20℃ 保存，冰袋運輸
交付內容
qPCR 原始資料
包含擴增曲線、熔解曲線原始圖譜，各樣本及對照的 Ct 值原始記錄表；
定量分析结果
絕對定量結果，對於病原體檢測等會直接給出樣本中目標核酸的拷貝數或濃度。相對定量結果，對於基因表達分析，常用 ΔΔCt 法計算基因表達的變化倍數。最終結果常以長條圖展示處理組相對於對照組（設為 1）的表達差異倍數。
實驗技術文件
提供引子序列資訊、反應體系配方、擴增程序參數，以及資料分析所用軟體與方法說明，便於實驗重複與資料重現。
常見問題
熔解曲線多峰代表存在非特異性擴增或引子二聚體，可透過以下方式優化：①重新設計特異性更高的引子（避免引子自身互補或交叉互補）；②調整引子濃度（控制終濃度在 0.1-1.0μM）；③優化退火溫度（可設置梯度 PCR 篩選最佳溫度）；④對 cDNA 模板進行梯度稀釋，降低模板濃度過高導致的非特異性結合。
①加樣時移液器未校準，導致模板或試劑加樣量不均，需定期校準移液器並規範操作；②反應體系配製時未充分混勻，應輕柔吹打或渦旋混勻體系；③qPCR 儀孔位溫度不均，可更換儀器或調整樣本擺放位置，同時增加生物學重複數量。
SYBR Green 法成本低、操作簡便，適合大批次樣本的常規定量（如基因表達分析），但特異性相對較低；TaqMan 探針法透過特異性探針實現標靶檢測，特異性與準確性更高，適合病原體精準檢測、轉基因成分鑑定等對特異性要求高的場景，但成本較高且引子探針設計難度大。
