蛋白質表達與檢測
提供從高靈敏度檢測到空間定位分析的全套方案，精準量化目標蛋白的表現水準
BiFC
雙分子螢光互補技術（Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC）是基於螢光蛋白片段重構原理，於活細胞內即時觀察蛋白質間相互作用及亞細胞定位的分子生物學技術。該技術突破傳統體外相互檢測（如 Pull-Down）無法反映細胞內生理環境的侷限，可在原生質體、完整組織或活體植株中直接驗證蛋白相互，兼具直觀性強、特異性高、無需受質與可動態追蹤的特點。BiFC 不僅能驗證已知蛋白間的相互作用，還可揭示相互發生的亞細胞位置（如細胞核、細胞質、細胞膜），廣泛應用於訊號路徑調控、蛋白複合物組裝與基因表達調控等領域。相較於酵母菌雙雜交（Y2H），BiFC 無需依賴報告基因活化，能更真實地模擬生物體內蛋白相互的天然條件，是細胞內蛋白相互研究中不可或缺的核心工具。
原理介紹
BiFC 技術的原理基於螢光蛋白的片段互補特性。以最常用的黃色螢光蛋白變體 Venus 為例，其被精確切割為 N 端片段（YN，通常為第 1-172 位胺基酸）和 C 端片段（YC，通常為第 155-238 位胺基酸）。這兩個片段單獨表達時均無螢光。當將 YN 片段與蛋白 A 融合（表達為 A-YN），YC 片段與蛋白 B 融合（表達為 B-YC），並共轉染至活細胞後，如果蛋白 A 與蛋白 B 發生特異性相互作用，便會將 YN 和 YC 兩個片段拉至足夠近的距離（通常 <10 nm）。在適宜的細胞環境下，這兩個片段能夠重新摺疊、組裝，形成與天然 Venus 蛋白高度相似的空間結構，恢復發出黃色螢光的能力。透過螢光顯微鏡直接觀察螢光訊號的出現及其在細胞內的位置，即可判斷兩個目標蛋白是否相互，以及相互發生的具體區域（如細胞核、細胞膜、細胞質等）。
文獻案例
《Plant Biotechnology Journal》發表題為「A fungal CFEM-containing effector targets NPR1 regulator NIMIN2 to suppress plant immunity」的研究論文，該研究藉助 BiFC 技術明確了真菌效應子 CfEC12 與植物免疫調控蛋白 MdNIMIN2 的相互關係及定位。為尋找 CfEC12 的相互蛋白，研究人員首先透過酵母菌雙雜篩庫篩選獲得 11 個候選蛋白，經 Y2H 實驗證實 MdNIMIN2 與 CfEC12 具有強烈相互作用。為進一步在活細胞內驗證該相互，建構 CfEC12-NYFP（N 端 YFP 融合）和 MdNIMIN2-CYFP（C 端 YFP 融合）重組載體，將兩種載體對應的農桿菌菌液按 1:1 比例混合後，瞬時轉化菸草葉片。培養 48h 後，透過雷射共聚焦顯微鏡觀察發現，菸草葉片表皮細胞的細胞核中出現明顯的 YFP 特異性螢光訊號，而陰性對照（CfEC12-NYFP + 空 CYFP 載體、MdNIMIN2-CYFP + 空 NYFP 載體）未觀察到螢光。這一結果直接證實 CfEC12 和 MdNIMIN2 可在植物細胞核內發生特異性相互作用，為後續闡明 CfEC12 透過標靶 MdNIMIN2 抑制植物免疫的分子機制奠定了關鍵基礎。
送樣標準
濃度≥500ng/μL，體積≥50μL，-20℃ 保存，冰袋運輸；需附帶測序報告及載體圖譜
新鮮葉片 / 癒傷組織＞1g / 份，4℃ 冷藏運輸，24h 內送達；需註明植物品種及生長狀態
細胞株需提供活力＞90% 的凍存細胞，乾冰運輸；原生質體需新鮮製備，冰袋運輸，12h 內送達；需註明細胞類型及培養條件
誘餌蛋白 / 獵物蛋白基因序列（FASTA 格式），需明確切割位點及融合方向
交付內容
螢光觀察原始資料
實驗組與對照組的雷射共聚焦顯微鏡照片、螢光訊號強度定量資料、亞細胞定位分析圖；
相互驗證報告
明確蛋白間是否存在相互作用的結論，結合螢光訊號分佈確定相互發生的亞細胞位置；
技術支援文件
提供實驗優化建議（如螢光片段選擇、轉化條件優化）、常見問題排查指南，以及後續驗證實驗（如 Co-IP、Pull-Down）的設計建議。
常見問題
①螢光片段自身存在自組裝活性，更換無自聚合傾向的螢光蛋白片段（如改進型 Venus 片段）；②載體建構過程中出現片段融合錯誤，重新測序驗證載體序列，確保螢光片段與蛋白正確連接；③細胞自身螢光干擾，選擇螢光背景更低的實驗材料，或使用更長發射波長的螢光蛋白（如 mCherry）；④降低融合蛋白表達量，更換弱啟動子載體，避免蛋白過量表達導致的非特異性結合。
①優化螢光蛋白片段組合，選擇重構效率更高的配對（如 SPYNE/SPYCE、YN155/YC155）；②增加載體轉染量，提高融合蛋白表達水平；③使用螢光增強劑，或在顯微鏡下延長曝光時間（避免過度曝光導致背景升高）；④選擇更靈敏的雷射共聚焦顯微鏡，優化激發光強度和檢測參數。
①使用純化的重組融合蛋白進行體外 BiFC 重構實驗，排除中間蛋白介導的間接相互；②建構蛋白截短體，明確關鍵相互結構域，若截短體仍能驅動螢光重構，證明兩者存在直接相互；③結合體外 Pull-Down 實驗，使用純化蛋白驗證直接結合，與 BiFC 結果相互印證。
