蛋白質表達與檢測
提供從高靈敏度檢測到空間定位分析的全套方案，精準量化目標蛋白的表現水準
Yeast Two-Hybrid
酵母菌雙雜交技術（Yeast Two-Hybrid, Y2H）是基於真核生物轉錄因子結構域分離與重構原理，於酵母細胞內研究蛋白質間相互作用的經典分子生物學方法。該技術突破體外相互檢測（如 Pull-Down）無法模擬細胞內生理環境的侷限，可在活細胞中直接驗證蛋白相互，兼具高特異性、高靈敏度、操作簡便且成本可控的特點。Y2H 技術不僅能驗證已知蛋白間的相互作用，還可透過 cDNA 文庫篩選誘餌蛋白的未知相互夥伴，廣泛應用於訊號路徑調控、蛋白複合物組成解析與疾病相關分子機制研究等領域。相較於免疫共沉澱（Co-IP），Y2H 無需純化蛋白或特異性抗體，能快速篩選大量潛在相互蛋白，是蛋白質相互作用網絡研究中高效的篩選與驗證工具。
原理介紹
的核心原理是利用真核生物轉錄因子（如 GAL4），其 N 端有一個由 147 個胺基酸組成的 DNA 結合域（DNA binding domain, BD），C 端有一個由 113 個胺基酸組成的轉錄活化域（transcription activation domain, AD）。GAL4 分子的 DNA 結合域可與上游活化序列（upstream activating sequence，UAS）結合，而轉錄活化域則能活化 UAS 下游的基因進行轉錄。但是，單獨的 DNA 結合域不能活化基因轉錄，單獨的轉錄活化域也不能活化 UAS 的下游基因，它們之間必須透過某種方式結合在一起才具有完整的轉錄活化因子功能。利用蛋白間的相互作用使 BD 與 AD 重構，活化下游報告基因表達，透過報告基因表型驗證相互關係。
文獻案例
《Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology》上發表題為「Hepatocyte Stress Increases Expression of YAP and TAZ and Promotes Fibrosis Through a Yes-Associated Protein-Transcriptional Enhanced Associate Domain–Dependent Mechanism」的研究論文。該研究旨在探究肝細胞應激如何透過 Hippo 路徑關鍵效應子 YAP/TAZ 驅動肝纖維化。研究人員推測，在應激的肝細胞中，被活化的 YAP 蛋白可能需要與特定的轉錄輔因子結合，才能啟動促纖維化基因程序。為了系統地尋找 YAP 在肝臟中的新型相互夥伴，他們採用了酵母菌雙雜交篩選這一經典方法。研究團隊以人類 YAP 蛋白的全長序列為「誘餌」，篩選了一個商業化的人類肝臟 cDNA 文庫。經過多輪嚴格的篩選與驗證，他們成功鑑定出轉錄增強子關聯結構域蛋白家族成員——TEAD4，是與 YAP 發生強相互作用的獵物蛋白之一。這一發現至關重要，因為它將肝細胞內的應激訊號與已知的、控制細胞增殖的 YAP-TEAD 轉錄複合物直接聯繫了起來。後續的細胞內驗證（如免疫共沉澱）證實了該相互在哺乳動物細胞中的存在。功能實驗進一步表明，在肝細胞特異性剔除 TEAD4 的小鼠中，由藥物誘導的肝纖維化程度顯著減輕。該研究清晰展現酵母菌雙雜交技術如何作為「發現引擎」，從一個關鍵的「誘餌」蛋白出發，鎖定其直接相互的「獵物」蛋白，從而揭示出 YAP-TEAD4 這對相互作用在傳導肝細胞應激訊號、驅動肝纖維化進程中的核心作用，為治療肝纖維化提供了新的潛在標靶。
送樣標準
序列需提供 FASTA 格式檔案；重組質體濃度≥500ng/μL，體積≥50μL，-20℃ 保存，冰袋運輸；需附帶測序報告
要求同誘餌蛋白載體，若為 cDNA 文庫需提供文庫濃度（≥100ng/μL）、庫容及插入片段長度資訊
需提供 Y2HGold、AH109 等合格菌株，-80℃ 甘油凍存，乾冰運輸；需註明菌株基因型及篩選標記
＞1g / 份，液氮速凍後 -80℃ 保存，乾冰運輸；需明確組織類型及處理條件（如脅迫處理、發育階段）
交付內容
自活化與毒性檢測報告
誘餌蛋白自活化檢測結果（培養基生長狀態、顯色情況）、毒性驗證結果（菌落生長狀態描述）；
共轉化與篩選結果報告
各對照組與實驗組在不同缺陷型培養基上的生長照片、顯色照片，明確相互陽性 / 陰性判定結論；
技術支援文件
提供實驗優化建議（如自活化去除、毒性緩解方法）、偽陽性 / 偽陰性排除指南，若為文庫篩選則提供潛在相互蛋白的基因序列及功能註釋報告。
常見問題
①蛋白間相互作用較弱，可延長四缺陷培養基的培養時間至 5-7 天，或降低培養基中 3-AT 的濃度；②誘餌蛋白與獵物蛋白在酵母細胞內未正確表達，透過 Western Blot 驗證融合蛋白表達情況，優化載體建構策略；③相互依賴特定轉譯後修飾（如磷酸化），酵母細胞無法提供該修飾，需結合體外 Pull-Down 實驗進一步驗證；④載體共轉化效率低，優化轉化條件（如調整 PEG 濃度、孵育時間）。
①降低誘餌蛋白表達量，更換弱啟動子載體，或在載體中引入誘導型啟動子；②建構誘餌蛋白截短體，去除毒性結構域，同時保留潛在相互結構域；③優化酵母培養條件，降低培養溫度至 28℃，或延長培養時間，為酵母生長提供更溫和的環境；④更換相容性更好的酵母菌株（如 AH109），減少蛋白毒性影響。
①回轉驗證：將篩選獲得的獵物蛋白載體與誘餌蛋白載體重新共轉化酵母，驗證相互重複性；②體外驗證：透過 Pull-Down 實驗，使用純化的重組蛋白驗證直接相互作用；③體內驗證：利用 Co-IP、雙螢光素酶互補等技術，於植物或動物細胞中驗證生理條件下的相互關係。
