转录组学
精准捕捉基因表达动态，揭示调控机制，为您还原不同实验条件下基因的响应模式。
SMART-Seq2
Smart-seq（Switching Mechanism at 5' end of RNA Template）是一种针对单细胞的全长 RNA 测序技术，核心优势在于能捕获完整的 mRNA 序列，克服了传统单细胞测序技术（如 10x Genomics）读长较短、5' 端覆盖不全的缺陷。该技术通过独特的逆转录引物设计，实现对单个细胞中 mRNA 的高效逆转录与全长 cDNA 扩增，可保留 mRNA 的 5' 端、3' 端及可变剪切信息，为基因表达定量、可变剪切分析、新转录本鉴定等研究提供高分辨率数据。2013年，报道了 SMART-seq2，该技术是经 SMART-seq 改进的一种测序方法，以提高单细胞RNA测序的效率和覆盖度。Smart-seq2的引物设计更加精确，可以更好地应对低质量RNA样本，并且在捕获基因表达信息时表现更为灵敏。
原理介绍
Smart-seq2 的核心原理是利用逆转录酶的模板转换（Template Switching）活性，结合优化的反应体系，实现单细胞 mRNA 的全长 cDNA 合成与均一扩增，关键步骤如下：裂解单个细胞释放 mRNA，mRNA 3' 端的 poly (A) 尾与带有 oligo (dT) 的逆转录引物结合，启动逆转录反应；当逆转录酶延伸至 mRNA 5' 端时，其模板转换活性会识别并结合一段经锁核酸（LNA）修饰的模板转换寡核苷酸（TSO），以 TSO 为模板继续延伸，形成包含 mRNA 全长序列的 cDNA 第一链，LNA 修饰可增强 TSO 与逆转录酶的结合稳定性，提升 5' 端捕获效率；采用高保真 DNA 聚合酶进行 PCR 扩增，通过优化引物浓度与循环数，减少扩增偏向性，实现 cDNA 的均一富集；对扩增后的 cDNA 进行片段化、接头连接等文库构建步骤，经高通量测序获得全长转录组数据，后续可开展多维度数据分析。
文献案例
《Genome Biology》期刊上发表的"ZAR1 and ZAR2 orchestrate the dynamics of maternal mRNA polyadenylation during mouse oocyte development. "通过审慎分析Smart-seq2的技术特点，澄清了关于卵母细胞中母源mRNA调控蛋白ZAR1功能的长年争议。此前两项使用Smart-seq2的研究得出了看似矛盾的结论。范衡宇团队敏锐地意识到，矛盾的根源可能在于技术本身：Smart-seq2依赖Oligo-dT引物捕获带polyA尾的mRNA。而在卵母细胞成熟后期，mRNA的polyA尾会发生显著缩短，这可能直接影响其被捕获的效率，从而造成对mRNA丰度变化的误判。为验证这一猜想，研究设计了一个关键实验：对同一发育阶段的卵母细胞，平行使用Smart-seq2和另一种不依赖polyA尾的Total RNA-seq技术进行分析。结果证实，Smart-seq2检测到的mRNA下调幅度确实被高估了，因为其polyA尾平均缩短至约8个核苷酸，导致捕获效率下降。这一发现表明，观测到的转录组动态主要反映了mRNA polyA尾长的变化，而非其总量的剧烈降解。研究由此重新解读了数据，并最终阐明ZAR1蛋白的真实功能是动态调控mRNA的polyA尾状态，而非简单地促进降解或稳定。
送样标准
＞1×10³ 个 / 份，PBS 洗涤后离心收集，用含 10% DMSO 的冻存液重悬，-80℃保存，干冰运输；需确保细胞活性＞85%
＞2×10³ 个 / 份，胰酶消化后离心收集，PBS 洗涤 2 次，冻存方式同上；需提供细胞系名称及培养条件
＞5×10³ 个 / 份，经酶解消化获得单细胞悬液，过滤去除杂质，细胞活性＞80%，-80℃保存，干冰运输；需注明组织类型
已分离的单个细胞，保存于含 RNase 抑制剂的裂解缓冲液中，冰袋运输，24h 内送达实验室
交付内容
文库质检报告
文库片段大小分布电泳图、浓度定量结果、完整性（RIN 值）检测数据；
原始测序数据
FASTQ 格式原始数据文件，附带数据质控报告（Q30≥85%）；
完整实验报告
涵盖实验原理、仪器与试剂信息、详细操作步骤（单细胞分离、逆转录、扩增、文库构建条件）、实验质控记录；
生信分析结题报告
包括数据预处理结果、基因表达定量矩阵、差异基因列表、可变剪切分析结果、细胞聚类图、功能富集分析（GO/KEGG）、关键基因表达验证建议等。
常见问题
①单细胞 mRNA 量过少：确保分离的细胞活性良好，避免细胞凋亡导致 mRNA 降解；②逆转录效率低：更换高质量逆转录酶，优化 TSO 与引物浓度比例；③PCR 循环数不足：可适当增加循环数（最多不超过 28 次），但需避免过度扩增导致的偏向性；④磁珠纯化损失：调整磁珠与样本的体积比，优化纯化条件，减少 cDNA 损失。
①优化逆转录反应条件：延长 42℃孵育时间至 120min，提高逆转录酶延伸效率；②选择带有修饰的 TSO（如锁核酸修饰），增强模板转换效率，确保 5' 端完整捕获；③减少 RNA 降解：全程冰上操作，所有试剂加入 RNase 抑制剂，避免样本反复冻融。
①标准化实验流程：严格控制单细胞分离、裂解、逆转录等步骤的操作时间与条件，确保批内一致性；②增加生物学重复：每个实验分组至少设置 3 个独立生物学重复，减少个体差异影响；③数据校正：通过内参基因（如 GAPDH、ACTB）进行表达量校正，或采用批次效应去除算法（如 ComBat）处理多批次数据。
