真核無參轉錄組測序服務-de novo組裝 | Verygenome

無參轉錄組

真核無參轉錄組（Eukaryotic De Novo Transcriptome, EDNT）針對無完整參考基因體或參考基因體品質極低（如組裝不完整、註釋缺失）的真核生物，透過高通量測序技術對細胞/組織中的mRNA（及非編碼RNA）進行系統性測序、從頭組裝轉錄本、定量分析和功能註釋。其核心優勢在於無需依賴已知基因體，可直接從測序資料組裝出物種專屬的轉錄本序列，實現基因表達定量與功能挖掘。相較於真核有參轉錄組，EDNT具三大核心價值：①物種無限制—適用於稀有物種、新發現物種、基因體未解析物種（如特有藥用植物、珍稀動物）；②新轉錄本挖掘—可發現物種特異性轉錄本、新基因、可變剪接異構體等未知遺傳資訊；③自主建構參考—組裝的轉錄組可作為該物種後續研究的「臨時參考」，為基因體測序與註釋奠定基礎。

原理介紹

真核無參轉錄組核心原理：樣品處理與RNA萃取，採「高完整性RNA富集策略」—①樣品破碎；②RNA萃取；③品質驗證。鏈特異性文庫建構—①RNA片段化；②逆轉錄；③接頭連接；④UDG酶消化；⑤PCR擴增，富集文庫片段。鏈特異性文庫可提升組裝準確性，尤其適合非編碼RNA註釋。高通量測序—採用Illumina二代測序平台，部分複雜物種可結合PacBio三代測序輔助組裝。資料分析與功能解析—①資料過濾；②從頭組裝；③定量分析；④功能註釋；⑤進階分析。

文獻案例

《PNAS》期刊發表之「How to upgrade stolen organelles into permanent plastids: A comparative transcriptomic perspective」聚焦兩種矽藻（D. kwazulunatalensis 與D. smirnovii）的次級內共生過程，兩者均缺乏完整參考基因體。研究團隊採用無參轉錄組測序技術對兩種矽藻進行比較轉錄組分析，鑑定與葉綠體整合相關的差異表達基因，發現D. kwazulunatalensis的細胞核基因體發生顯著重構，表達完整的己糖磷酸輸出路徑，表明其與葉綠體的代謝整合程度更深，為理解真核生物次級內共生機制提供新視角。透過無參轉錄組從頭組裝，克服兩種矽藻缺乏參考基因體的限制，實現對次級內共生過程中基因表達變化的系統分析，揭示葉綠體從竊取細胞器向永久細胞器轉化的分子機制。

送樣標準

組織樣品

動物組織≥50mg；植物組織≥200mg；FFPE組織：≥20張切片（5-10μm），且RNA總量≥5μg。

細胞樣品

貼壁細胞：≥2×10⁶個；懸浮細胞：≥3×10⁶個；細胞爬片：≥8張。

體液樣品

血清/血漿：≥8mL；腦脊髓液≥3mL、尿液≥15mL；唾液：≥5mL。

RNA樣品

總量≥2μg。

交付內容

原始資料

測序原始文件（FASTQ格式），提供MD5校驗碼確保資料完整性；測序儀輸出報告。

資料品質管制報告

RNA品質評估；測序品質評估；組裝品質評估。

unigene組裝與註釋結果

組裝結果；表達量矩陣；差異分析結果；資料庫註釋、路徑歸屬資訊、序列同源性分析結果。

進階分析結果

新基因預測—物種特異性新基因序列與功能註釋；SSR標記開發—SSR位點資訊；可變剪接分析—剪接事件類型與差異剪接unigene清單；轉錄因子預測—轉錄因子家族分類與標的基因關聯分析。

分析與解讀報告

檢測結論—核心差異unigene集合、關鍵路徑富集結果、潛在功能基因/SSR標記候選；結果解讀—差異unigene的生物學功能、與物種性狀/處理條件的關聯、組裝轉錄本的應用價值。

常見問題

真核無參轉錄組測序（RNA-seq）CDS和ORF的區別?

在真核無參轉錄組測序中，CDS是編碼蛋白質的一段序列，ORF是從起始密碼子到終止密碼子的一段序列；並非所有讀碼框都能表達出蛋白質，也就是說CDS一定是ORF，但ORF不一定是CDS，一般ORF只是理論上的一個編碼區，CDS則較接近實際情況。預測CDS時先與資料庫比對，比對上的直接萃取CDS序列，比對不上的再用軟體預測。

組裝品質的核心評估指標（如N50、BUSCO）是什麼意思？多少算合格？

核心指標與合格標準：①N50—將所有unigene按長度由長到短排序，累計長度達總長度50%時的unigene長度，反映組裝片段完整性；常規物種N50≥1000bp為合格，複雜物種（多倍體、高重複序列）≥1500bp為優質。②BUSCO—評估組裝轉錄本與近緣物種保守基因的匹配度，反映組裝完整性；≥70%為合格，≥85%為優質（植物樣品≥75%，動物樣品≥80%）。③冗餘率—重複序列占比≤15%為合格（CD-HIT去冗餘後）。④註釋率—≥60%為合格，≥75%為優質。

植物樣品富含多醣/多酚，會影響無參轉錄組結果嗎？如何處理？

會顯著影響：①影響—多醣/多酚會抑制RNA萃取效率，導致RNA降解、純度下降（OD260/230＜1.5），進而降低組裝品質（N50下降30%以上）；②處理方案—a. 採樣後立即液氮速凍，避免多醣/多酚降解放出；b. 萃取時添加PVP（聚乙烯吡咯烷酮）與β-巰基乙醇，結合CTAB法去除多醣/多酚；c. 選用植物專用RNA萃取試劑盒；d. 若RNA純度不達標，透過乙醇沉澱+LiCl純化進一步去除雜質。

無參轉錄組的定量準確性比有參低，該如何彌補？

透過「技術優化+實驗驗證」彌補：①技術優化—a. 採用鏈特異性文庫提升轉錄本定位準確性；b. 使用RSEM工具進行定量；c. 增加生物學重複，透過統計檢定降低偽陽性。②實驗驗證—對核心差異unigene進行qPCR驗證，確保表達趨勢一致。③資料校正—與近緣物種有參轉錄組進行同源比對，校正定量結果。

無參轉錄組組裝的unigene可作為後續研究的「參考基因體」嗎？

可作為「臨時參考轉錄組」，但無法完全替代基因體：①適用場景—可用於後續基因選殖、表達定量、SSR標記開發等研究，是物種基因體測序前的重要參考；②侷限性—unigene是轉錄本序列，無法反映基因在染色體上的位置、內含子完整資訊、非轉錄區域等基因體特徵。

轉錄組學