lncRNA 測序

長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, lncRNA)為一類長度超過200 nt的長鏈非編碼RNA,透過與DNA、RNA或蛋白質結合,於表觀遺傳、轉錄及轉錄後等層次調控基因表達。lncRNA測序針對有參考基因體樣品開展準確的lncRNA鑑定與lncRNA標的基因預測,同時提供測序資料中mRNA的分析,結果更全面,廣泛應用於醫學、農學研究領域。

原理介紹

利用高通量測序技術進行lncRNA測序及生物資訊分析,可快速準確地發現具重要調控功能的lncRNA,分析其與特定生物學過程的關係,深入探索lncRNA的功能及其表達調控機制,包含競爭結合miRNA的ceRNA調控機制,及對染色質結構(如增強子、啟動子、絕緣子)的一系列調控。取得Total RNA樣品進行rRNA去除、cDNA合成(鏈特異性建庫),加入fragmentation buffer將RNA打斷成250–300bp短片段,以六鹼基隨機引物合成一鏈cDNA;加入緩衝液、dNTPs與DNA polymerase I合成二鏈cDNA,利用AMPure XP beads純化雙鏈cDNA;末端修復加接頭,純化的雙鏈cDNA再進行末端修復、加A尾並連接測序接頭,用AMPure XP beads進行片段大小選擇,用USER酶降解含U的cDNA第二鏈,用AMPure XP beads進行片段大小選擇。

文獻案例

《Molecular Cancer》期刊上「Integrative Multi-Omics Analysis Reveals the lncRNA 60967.1–PLCD4–ATRA Axis as a Key Regulator of Colorectal Cancer Progression and Immune Response」的研究論文透過多組學分析(轉錄組、蛋白質體、代謝組)發現lncRNA 60967.1在CRC組織中顯著下調,其過表達可恢復腫瘤抑制基因PLCD4的表達,提高全反式視黃酸(ATRA)層次,進而增強IFN-γ誘導的凋亡、增加IFNGR1表達,部分逆轉IFN-γ抗性。於小鼠模型中,lncRNA 60967.1過表達促進免疫細胞浸潤,與抗PD-1治療協同抑制腫瘤生長。該研究揭示了lncRNA-代謝物-免疫微環境的調控網路,為CRC免疫治療提供新標的。

送樣標準

新鮮動物組織乾重

內臟組織、腦組織≥0.2g,脂肪、皮膚、骨頭、血管等其他組織≥0.4 g。

新鮮植物組織乾重

葉片、花≥0.2g,根、莖、種子等其他組織≥0.7 g。

新鮮培養細胞

≥5×10⁶個。

新採集的全血

≥3ml(EDTA抗凝管)。

Total RNA建庫起始量

總量:≥1ug;濃度:≥50ng/uL。

交付內容

品質管制

對原始資料進行去除接頭、污染序列及低品質reads的處理,資料產出統計及測序資料的成分和品質評估。

參考序列比對分析拼接

序列拼接組裝、lncRNA篩選、新預測lncRNA結構特徵分析。

表達層次分析

樣品間相關性分析、cis作用標的基因預測。

lncRNA標的基因預測

trans作用標的基因預測。

差異分析

差異表達層次分析、GO富集分析、功能富集分析、KEGG富集分析、差異表達基因的蛋白互作網路分析、可變剪接分析。

結構分析

融合基因分析、SNP/InDel分析。

常見問題

哺乳動物基因體序列約5%–10%被穩定轉錄,蛋白質編碼基因僅約佔1%,其餘4%–9%的序列皆轉錄為非編碼RNA。而非編碼RNA(non-coding RNA)是指不能轉譯為蛋白的功能性RNA分子。長鏈非編碼RNA為這4%–9%中長度大於200nt的非編碼RNA。其作用主要體現於四個方面:第一,影響周邊基因的表達;第二,調控蛋白質活動及定位;第三,產生小分子RNA;第四,對其他RNA的調控作用。

進行lncRNA測序分析對物種有以下要求:a. 物種為真核生物;b. 物種具有參考基因體,至少拼接至scaffold層次;c. 具有較為完整的註釋。

可以,關聯分析思路類似lncRNA和mRNA的關聯分析,即蛋白質體差異表達蛋白與差異表達lncRNA標的基因編碼蛋白的交集分析(聚類、功能富集)。

長鏈非編碼RNA建庫主要採去除rRNA、建構鏈特異性文庫,目前建庫較為穩定。適用於人、鼠、動植物等物種。

Tophat和Cufflinks(建構轉錄本)、Infernal(家族分類)、CPC(對轉錄本編碼能力進行預測)、Blast(比對)、SOAP(過濾實驗中未去除乾淨的rRNA,及lncRNA表達定量比對)。

可以,長鏈非編碼RNA建庫模式採去核糖體方式建庫,對所獲得的RNA進行打斷測序,相當於獲得全部RNA,即可進行環狀RNA表達情況的分析,可應用於分析各物種環狀RNA表達譜。

人標品:已知mRNA定量與qPCR定量斯皮爾曼係數達到0.88。

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