轉錄組學
精準捕捉基因表現動態，揭示調控機制，為您還原不同實驗條件下基因的響應模式。
SMART-Seq2
Smart-seq（Switching Mechanism at 5′ end of RNA Template）是一種針對單細胞的全長RNA測序技術，核心優勢在於能捕獲完整的mRNA序列，克服傳統單細胞測序（如10x Genomics）讀長較短、5′端覆蓋不全的缺陷。該技術透過獨特的逆轉錄引物設計，實現對單個細胞中mRNA的高效逆轉錄與全長cDNA擴增，可保留mRNA的5′端、3′端及可變剪接資訊，為基因表達定量、可變剪接分析、新轉錄本鑑定等研究提供高解析度資料。2013年報導了SMART-seq2，該技術為經SMART-seq改進的測序方法，以提高單細胞RNA測序的效率與覆蓋度。Smart-seq2的引物設計更加精確，能更好地應對低品質RNA樣品，且在捕獲基因表達資訊時表達更為靈敏。
原理介紹
Smart-seq2的核心原理是利用逆轉錄酶的模板轉換（Template Switching）活性，結合最佳化的反應體系，實現單細胞mRNA的全長cDNA合成與均一擴增，關鍵步驟如下：裂解單個細胞釋放mRNA，mRNA 3′端的poly(A)尾與帶有oligo(dT)的逆轉錄引物結合，啟動逆轉錄反應；當逆轉錄酶延伸至mRNA 5′端時，其模板轉換活性會識別並結合一段經鎖核酸（LNA）修飾的模板轉換寡核苷酸（TSO），以TSO為模板繼續延伸，形成包含mRNA全長序列的cDNA第一鏈，LNA修飾可增強TSO與逆轉錄酶的結合穩定性，提升5′端捕獲效率；採用高保真DNA聚合酶進行PCR擴增，透過最佳化引物濃度與循環數，減少擴增偏向性，實現cDNA的均一富集；對擴增後的cDNA進行片段化、接頭連接等文庫建構步驟，經高通量測序獲得全長轉錄組資料，後續可開展多維度資料分析。
文獻案例
《Genome Biology》期刊發表之「ZAR1 and ZAR2 orchestrate the dynamics of maternal mRNA polyadenylation during mouse oocyte development.」透過審慎分析Smart-seq2的技術特點，澄清了關於卵母細胞中母源mRNA調控蛋白ZAR1功能的長年爭議。先前兩項使用Smart-seq2的研究得出看似矛盾的結論。范衡宇團隊敏銳地意識到，矛盾根源可能在於技術本身：Smart-seq2依賴Oligo-dT引物捕獲帶polyA尾的mRNA。而在卵母細胞成熟後期，mRNA的polyA尾會顯著縮短，可能直接影響其被捕獲的效率，造成對mRNA豐度變化的誤判。為驗證此猜想，研究設計了一個關鍵實驗：對同一發育階段的卵母細胞，平行使用Smart-seq2與另一種不依賴polyA尾的Total RNA-seq技術進行分析。結果證實，Smart-seq2檢測到的mRNA下調幅度確實被高估了，因為其polyA尾平均縮短至約8個核苷酸，導致捕獲效率下降。此發現表明，觀測到的轉錄組動態主要反映mRNA polyA尾長的變化，而非其總量的劇烈降解。研究由此重新解讀資料，最終闡明ZAR1蛋白的真實功能是動態調控mRNA的polyA尾狀態，而非簡單地促進降解或穩定。
送樣標準
＞1×10³ 個 / 份，PBS洗滌後離心收集，用含 10% DMSO 的凍存液重懸，-80℃保存，乾冰運輸；需確保細胞活性＞85%
＞2×10³ 個 / 份，胰酶消化後離心收集，PBS 洗滌 2 次，凍存方式同上；需提供細胞系名稱及培養條件
＞5×10³ 個 / 份，經酶解消化獲得單細胞懸液，過濾去除雜質，細胞活性＞80%，-80℃保存，乾冰運輸；需註明組織類型
已分離的單個細胞，保存於含RNase抑制劑的裂解緩衝液中，冰袋運輸，24h內送達實驗室
交付內容
文庫質檢報告
文庫片段大小分布電泳圖、濃度定量結果、完整性（RIN值）檢測資料；
原始測序資料
FASTQ格式原始資料文件，附帶資料品質管制報告（Q30≥85%）；
完整實驗報告
涵蓋實驗原理、儀器與試劑資訊、詳細操作步驟（單細胞分離、逆轉錄、擴增、文庫建構條件）、實驗質控記錄；
生資分析結題報告
包括資料前處理結果、基因表達定量矩陣、差異基因清單、可變剪接分析結果、細胞聚類圖、功能富集分析（GO/KEGG）、關鍵基因表達驗證建議等。
常見問題
①單細胞mRNA量過少—確保分離的細胞活性良好，避免細胞凋亡導致mRNA降解；②逆轉錄效率低—更換高品質逆轉錄酶，最佳化TSO與引物濃度比例；③PCR循環數不足—可適當增加循環數（最多不超過28次），但需避免過度擴增導致的偏向性；④磁珠純化損失—調整磁珠與樣品體積比，最佳化純化條件，減少cDNA損失。
①最佳化逆轉錄反應條件—延長42℃孵育時間至120min，提高逆轉錄酶延伸效率；②選擇帶有修飾的TSO（如鎖核酸修飾），增強模板轉換效率，確保5′端完整捕獲；③減少RNA降解—全程冰上操作，所有試劑加入RNase抑制劑，避免樣品反覆凍融。
①標準化實驗流程—嚴格控制單細胞分離、裂解、逆轉錄等步驟的操作時間與條件，確保批內一致性；②增加生物學重複—每個實驗分組至少設置3個獨立生物學重複，減少個體差異影響；③資料校正—透過內參基因（如GAPDH、ACTB）進行表達量校正，或採用批次效應去除演算法（如ComBat）處理多批次資料。
