動植物 T2T 基因組測序

T2T 基因體(Telomere-to-Telomere)採用 PacBio HiFi 高精度長讀長、ONT 超長讀長與 Hi-C 等技術組合,實現一條或多條染色體從端粒到端粒的無缺口(gap)完整組裝,解決傳統基因體草圖中端粒、著絲粒與核糖體 DNA 等複雜重複區域的序列缺失問題。目前已在水稻、阿拉伯芥、葡萄及人類等物種中成功建構高品質 T2T 參考基因體,顯著提升基因體連續性與基因註釋完整性,為動植物生物學研究與育種實踐提供全新視角。

原理介紹

T2T(Telomere-to-Telomere)基因體是指透過多種測序手段、高深度測序序列組裝,獲得 0 gap 或近 0 gap 的高品質基因體。T2T 基因體克服了著絲粒及高重複區域的組裝困難,染色體的連續性和完整性大幅提高,有助於對基因體中高重複序列區域或高重複結構進行深入研究。測序策略採用 PacBio HiFi 與 Nanopore Ultra-long 雙平台結合:HiFi 測序讀長準確度高(reads N50 約 15 Kb,Q30 ≥ 75%),實現高保真組裝;Nanopore Ultra-long reads 可達 Mb 級別,輕鬆跨越基因體高重複及高複雜區域。兩種資料分別組裝後經合併、糾錯,並結合 Hi-C 資料掛載到染色體水平,完成高品質 T2T 基因體的建構。

實驗流程

1

樣本檢測

對樣本進行品質檢測,確保樣本品質滿足後續 DNA 萃取和測序要求,評估建庫可行性與長讀長測序適配性,確定測序策略,保障專案順利

2

DNA 萃取

萃取高純度、高完整性的基因體 DNA,檢測濃度與完整性,滿足長讀長建庫需求,為 T2T 級組裝奠定基礎,全面保障組裝品質與完整性

3

文庫建構

分別建構 PacBio HiFi 文庫(環形 DNA 多次讀取提高精度)與 ONT Ultra-long 文庫(讀取更長序列),兩者互補

4

上機測序及品質控制

PacBio revio 平台 HiFi 測序,Nanopore 平台 Ultra-long 測序,以工具完成品質統計,確保資料合格

5

資料組裝

以 hifiasm、NextDenovo 等軟體組裝,結合 Hi-C 掛載至染色體水平,填補 gap 並延伸端粒,完成高品質組裝

6

組裝評估

從基因體大小、連續性(N50)、完整性(BUSCO)、一致性(二代回比)、QV 值等維度評估,全面確保組裝品質,達到 T2T 標準

7

基因體註釋

重複序列與 ncRNA 鑑定註釋,結合同源預測、從頭預測與 EVM 整合完成基因結構註釋與功能基因集構建,深入支撐後續研究

送樣標準

樣本類型

動物組織、動物細胞、血液、植物樣本、昆蟲樣本、海洋軟體動物等。

所需寄送量

動物組織 3×10^6 cells、動物細胞 3×10^6 cells、血液樣本 2 mL、植物樣本 2 g、昆蟲樣本 1 g;建庫一次用量分別為 1×10^6 cells、1×10^6 cells、1 mL、300 mg、100 mg。

取材建議

De novo 組裝專案,單一個體可獲取足量材料時建議從同一個體取材製備各類型文庫(PacBio、Illumina 小片段、ONT、Hi-C 等),且以相同組織部位最佳;單一個體不足時應確保各文庫 DNA 來源同一混池,並盡量減少混合個體數量、保證親緣關係接近。

血液樣本

添加 EDTA 抗凝劑(不接受其他抗凝劑),4℃ 保存並在採集後三天內寄送;無法保證則液氮速凍 30 min 後 -80℃ 保存,乾冰運輸。

細胞樣本

建議細胞總量 ≥ 2.0×10^6 cells,凍存前活率 > 75%,使用含 20% FBS 與 10% DMSO 的凍存液,-80℃ 或液氮保存,乾冰運輸。

動物組織

優先選取高細胞性低脂肪組織(血液 > 精子細胞 > 脾臟 > 心臟),液氮速凍 30 min,-80℃ 保存,乾冰運輸。

植物樣本

優先幼嫩活體組織,新鮮組織用無菌水沖洗 ≥ 3 次並吸乾水分後收集於凍存管,液氮冷凍,-80℃ 保存,乾冰運輸。

昆蟲樣本

發育階段優先級為胚胎 > 新孵幼蟲 > 早期蛹 > 成蟲;液氮速凍前需飢餓處理數天,-80℃ 保存,乾冰運輸。

寄送要求

順豐次日達或當日達,液氮速凍樣本用足量乾冰寄送,並附完整樣本資訊單。

交付內容

原始資料

PacBio HiFi、Nanopore Ultra-long 及 Hi-C 測序資料(含品質控制報告與資料統計表);

組裝結果

T2T 級基因體序列 FASTA 檔案、gap 填補與端粒修復結果、Hi-C 掛載染色體結果;

組裝評估報告

基因體大小、Contig N50/Scaffold N50、BUSCO 完整性評估、二代資料回比一致性、QV 品質值評估表與圖表;

重複序列註釋結果

RepeatMasker 鑑定結果含 LTR/TIR/LINE/SINE 等轉位子的分類統計表與分佈圖;

ncRNA 註釋結果

基於 Infernal/Rfam 資料庫註釋的 miRNA、tRNA、rRNA、snRNA、snoRNA 序列與基因體位置資訊表;

基因集

同源預測 + 從頭預測 + EVM 整合 + PASA 更新後的基因結構註釋 GFF3 檔案;

基因功能註釋

GO、KEGG、InterPro、SwissProt、NR 等資料庫的功能註釋結果表;

結題報告

含方法描述、結果圖表與解讀的 T2T 基因體註釋分析完整 PDF 報告。

常見問題

T2T(Telomere-to-Telomere)基因體透過三代長讀長測序實現 0 gap 或近 0 gap 組裝,解決了著絲粒和高重複區域組裝難題,染色體連續性和完整性顯著優於普通參考基因體,適合高重複序列區域研究。

主要從四個維度評估:組裝連續性(N50)、組裝完整性(BUSCO)、組裝一致性(二代資料回比)以及 QV 品質值,高 QV 值意味著組裝結果更可靠、錯誤率更低。

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