CLIP-seq 測序服務-RBP 結合位點精確定位 | Verygenome

CLIP-Seq

紫外交聯免疫沉澱結合高通量測序（Cross-Linking and Immunoprecipitation followed by sequencing, CLIP-seq），是一種用於在全基因體水平上研究 RNA 結合蛋白（RNA-binding proteins, RBPs）與其標的 RNA 之間相互作用的高通量測序技術。在全基因體範圍內高通量、高精度地鑑定 RNA 結合蛋白與 RNA 相互作用位點的革命性技術。在傳統分子生物學中，研究 RNA-蛋白質相互作用多採用 RNA 免疫沉澱技術，但該方法背景雜訊高，無法區分直接結合與間接結合。CLIP-seq 透過紫外交聯將 RNA 與蛋白在體內原位「凍結」，形成共價鍵，從而確保後續檢測到的相互是直接、真實的。它的出現極大地推動了 RNA 生物學領域的發展，特別是在轉錄後調控的研究中，已成為不可或缺的工具。

原理介紹

CLIP-seq 的核心原理是利用紫外交聯將 RBP 與其結合的 RNA 在體內瞬間共價交聯，隨後透過免疫沉澱特異性富集該 RBP 及其結合的 RNA 片段，再經過文庫建構與高通量測序，最終精確定位 RBP 在全轉錄組上的結合位點。

文獻案例

《Scientific Reports》期刊上發表"Widespread binding of FUS along nascent RNA regulates alternative splicing in the brain. "研究論文利用 iCLIP 技術在小鼠腦中繪製 FUS 全轉錄組結合圖譜，發現 FUS 沿新生 pre-mRNA 全長廣泛分佈，結合模式呈「鋸齒狀」，提示其在轉錄早期即結合並伴隨剪接完成；其序列偏好極弱，僅輕微富集 GGU 基序。在 FUS 剔除小鼠中，多數受調控外顯子包含率升高，表明 FUS 主要抑制外顯子納入。被抑制外顯子兩側顯著富集 FUS 結合訊號，且與剪接因子 U2AF65 共定位。儘管 FUS 與 TDP-43 結合位點幾乎無重疊，二者卻共同調控神經發育與神經退化相關基因，揭示其在 ALS/FTLD 中的平行致病路徑。

實驗流程

紫外交聯與細胞裂解

UV 254 nm 交聯 RBP-RNA 複合物，以含抑制劑的裂解液超音波破碎染色質，保留 RNA 結合資訊，確保相互作用真實

免疫沉澱

抗目標 RBP 特異性抗體與 Protein A/G 磁珠共孵育，4℃ 隔夜捕獲複合物，高鹽洗滌去除非特異結合，保障沉澱特異性

去磷酸化與接頭連接

MNase 或 RNase T1/A 適度消化，PNK 去磷酸化，3′ 與 5′ 接頭依次連接，為後續文庫建構與擴增做好充分準備

SDS-PAGE 純化與蛋白酶 K 消化

SDS-PAGE 分離 RNP 複合物，切取 RBP 位置上方位帶，蛋白酶 K 消化釋放 RNA 片段，供後續反轉錄與文庫建構使用

RNA 反轉錄與文庫擴增

反轉錄為 cDNA 後 PCR 擴增建構鏈特異性文庫，Bioanalyzer 評估片段大小與濃度，確認文庫品質合格可用於上機測序

上機測序

Illumina 高通量平台 PE150 模式測序，保證 IP 樣品 reads 數（建議 ≥40 M reads/樣本），保障資料量

生資分析

資料品質控制、參考基因體比對、Peak 鑑定與註釋、Motif 分析、差異結合位點分析與功能富集，解析 RBP 調控機制，輸出完整報告

送樣標準

細胞樣品

- 細胞應處於對數生長期，生長狀態良好，無污染。 - 每個實驗專案建議提供 ≥3×10⁷ 個活細胞（如 HeLa 細胞約相當於 3 個 15 cm 培養皿），建議 ≥5×10⁷ 個，以保障後續富集效率。 - 對於核定位 RNA 結合蛋白，建議提供乾體積 ≥300 μL 的細胞；對於胞質定位蛋白，建議 ≥100 μL。 - 必須提供至少一管用於預實驗驗證的樣本（約正式量的 1/10），便於評估抗體特異性與結合效率。 - 細胞收集應在 90% 匯合度時進行，避免過度融合影響蛋白活性。 - 收集後立即液氮速凍，-80℃ 保存，並採用乾冰運輸。

動物組織

- 總重量 ≥200 mg，優先使用新鮮組織。 - 取材後立即用冰冷生理鹽水沖洗，去除血漬、脂肪及結締組織等雜質。 - 儘快剪切成小塊（≤5 mm³），防止 RNA 降解。 - 立即投入液氮中速凍至少 1 分鐘，隨後轉移至 -80℃ 長期保存。 - 運輸方式：乾冰運輸，或置於 Trizol 中乾冰運輸。

植物組織

- 推薦選取嫩葉、根尖、幼苗等代謝活躍部位。 - 葉片類組織用無菌水沖洗並擦乾水分，錫箔紙包裹後迅速液氮速凍。 - 根莖類組織需剪成小段，裝入 1.5 mL EP 管中，立即液氮速凍。 - 建議每種樣本準備 2–3 份，以便重複實驗或品質控制使用。 - 運輸方式：乾冰運輸。

交付內容

原始資料與品質控制

FASTQ 格式測序原始資料、FASTQC 品質控制報告（基礎測序品質、GC 含量、序列長度分佈）；

內部實驗品質控制

片段大小分佈圖、訊噪比評估結果、交聯特徵（片段長度、UV 交聯位點突變）分析報告；

標準分析內容

Peak 識別與註釋結果列表、Motif 分析结果、Peak 相關基因 GO/KEGG 功能富集分析；

進階分析

多組間差異結合分析、結合 RNA-seq 資料進行剪接調控整合分析、多組學資料聯合分析建構調控網絡圖。

常見問題

紫外交聯在捕捉真實相互作用的同時，引入了哪些不可避免的實驗干擾？

254nm 紫外交聯在固定瞬時相互時，其能量本身會誘導 RNA 損傷和突變，並可能導致非特異性交聯。更重要的是，不同 RBP-RNA 對的交聯效率存在固有差異，這引入了系統性偏差，使得 CLIP-seq 資料更適用於高精度定位結合位點（定性分析），而對不同位點間結合親和力的絕對定量解讀需格外審慎。

CLIP-seq 中背景雜訊的主要來源與校正的 core 是什麼？

背景雜訊主要源於抗體的非特異性吸附及 RNA 酶的不完全消化。其校正的 core 在於必須設置匹配的陰性對照（如 IgG 或剔除樣本），並在生物資訊分析中以此為基礎進行背景減除。若無此步驟，將產生大量偽陽性峰，導致後續所有基序與功能分析失去意義。

如何理解 CLIP-seq 靜態「結合快照」與細胞內動態調控網絡之間的差距？

CLIP-seq 提供的是交聯瞬間的靜態結合圖譜，無法捕捉 RBP 結合的順序性、瞬時性及協同性等動態資訊。因此，一個強烈的結合訊號可能代表穩定的結構性結合，也可能僅是瞬態的催化性事件。要將結合位點轉化為調控機制，必須將 CLIP 資料與 RBP 功能擾動後的動態轉錄組或剪接體變化相結合，以推斷因果關係。

表觀遺傳學