表觀遺傳學
解析非序列層面的遺傳修飾規律，探索環境如何透過修飾影響基因表現。
m6A-Seq
M6A-Seq（甲基化 RNA 免疫沉澱測序，meRIP-seq）利用特異性抗體富集發生 N6-甲基腺苷（m6A）修飾的 RNA 片段，再進行高通量測序，從而在全轉錄組範圍內鑑定 RNA 甲基化位點，是研究 RNA 表觀遺傳修飾與應用的重要技術。
原理介紹
MeRIP-seq（Methylated RNA Immunoprecipitation followed by sequencing），又稱 m6A-seq，是一種在全轉錄組範圍內檢測 RNA 上 N6-甲基腺苷（m6A）修飾位點的技術。m6A 是真核生物 mRNA 和非編碼 RNA 中最豐富、研究最廣泛的內部化學修飾，參與調控 RNA 的剪接、出核、穩定性、轉譯等過程，是研究表觀轉錄組學的關鍵工具。技術原理：將總 RNA 或 poly(A) RNA 片段化成約 100-200 nt 的小片段，使用抗 m6A 特異性抗體進行免疫沉澱，富集含 m6A 修飾的 RNA 片段；同時取一部分未經免疫沉澱的片段化 RNA 作為 Input 對照。對 IP 和 Input 分別建庫測序，比較兩者測序讀段富集情況，即可在全轉錄組範圍內鑑定 m6A 修飾峰。
實驗流程
RNA 萃取與片段化
萃取總 RNA 並以 poly(A) 磁珠富集 mRNA，化學法或 RNase III 酵素法隨機打斷成小片段，供後續免疫沉澱使用
免疫沉澱
片段化 RNA 分成兩份，一份與抗 m6A 抗體及 Protein A/G 磁珠共孵育沉澱，另一份作為 Input 對照，確保結果可信
洗滌與洗脫
嚴格洗滌去除非特異性結合 RNA，以含游離 m6A 核苷的緩衝液競爭性洗脫或 TRIzol 萃取 RNA，獲得高純度目的片段
RNA 純化
分別純化 IP 洗脫 RNA 和 Input RNA，檢測濃度與品質，確保滿足文庫建構需求，保障文庫構建品質，供後續建庫測序使用
文庫建構與測序
IP 與 Input RNA 分別經去磷酸化、加接頭、反轉錄與 PCR 擴增，建構鏈特異性文庫並測序，全面獲取高品質原始資料
生資分析
資料品質控制、比對、Peak 檢測與註釋、Motif 分析、差異 Peak 分析及功能富集分析，全面解析 m6A 修飾特徵，輸出完整報告
送樣標準
基因體 RNA、新鮮冷凍組織、培養細胞、植物樣本。
提供 ≥ 100 μg 純淨 RNA，去除 RNA 及蛋白殘留；RIN > 7；28S:18S > 1.5；OD260/280 1.6–2.3；無明顯降解；進行去蛋白和 DNase 處理。
取樣量不少於 500 mg，離體後立即用生理鹽水清洗、吸乾、冰上切塊，液氮速凍，-80℃ 保存。
提供不少於 3×10^7 個細胞，PBS 洗滌一次後 600 g 4℃ 離心 5 min 棄上清，液氮速凍，-80℃ 保存。
取幼嫩葉片等富含核酸部位，總量不少於 5 g；多酚或多醣類植物建議增加送樣量或提前萃取 RNA。
一律乾冰運輸。
交付內容
序列分析结果
參考基因體比對率、Reads 測序深度累積分佈、Reads 在基因上下游/染色體/功能元件上的分佈圖與統計表；
Peak 檢測與註釋
Peak 檢測結果檔案、Peak 在基因體與功能元件上的分佈、Peak 相對 TSS 距離分佈圖；
Peak 相關基因富集分析结果
GO 與 KEGG 路徑富集散佈圖、Top 20 路徑列表與差異 Peak 相關基因註釋表；
Motif 分析结果
基於 HOMER/MEME 的 m6A 修飾位點周圍序列 motif 鑑定結果與 motif 在 Peak 中的位點分佈圖；
差異 Peak 分析
差異 Peak 結果列表、火山圖、差異 Peak 在功能元件上的分佈圖與統計表；
差異 Peak 富集與 Motif 分析
差異 Peak 相關基因 GO/KEGG 富集結果及 motif 在差異 Peak 中的富集分析；
結題報告
含 IGV 使用說明、方法描述與全部結果附件的 m6A-seq 完整分析 PDF 報告。
常見問題
MeRIP-seq 技術平台同樣適用於 m7G、m5C、ac4C 等其他 RNA 修飾的檢測，只需更換對應的特異性抗體即可，實驗流程與資料分析方法一致。
